Stanovení obsahu fruktanů metodou HPLC s refraktometrickou detekcí Fructan Content Determination by HPLC Method with Refractomeric Detection
The method for fructan content determination using HPLC with refractometric detection and NH2 column has been implemented
and internally validated. As well as other method, this method is based on the balance of glucose and fructose before and
after hydrolysis of fructans by inulinase. In the first phase of testing under optimized chromatographic conditions, very
good properties of NH2 column for separation of glucose, fuctose, saccharose, 1-kestose, nystose and 1-F-fructofuranosylnystose
mixture have been demonstrated. During the internal validation of fructan determination in standard material, standard
deviation sr = 0.2; expanded uncertainty of measurement U = ±0.4 % and mean recovery 97.9 % were determined. Standard
deviations of fructan determinations in commercial materials Orafti P95, Orafti GR and Actilight 950P were very low,
i.e. 0.04 and 0.05 respectively, which corresponds to the extended uncertainty of measurements U = ±0.1 %. Mean recovery
of fructan determination, indicatively assessed by comparison with the fructan contents declared by the producer,
ranged from 96.9–99.3 %. The method also allows a good separation and identification of individual fructan oligomers
with DP 2–6 (both types GFn and Fn). These properties can be used to distinguish between different kinds of fructans.
It can be concluded that the proposed method gives good prerequisites for the determination of fructans. After
verification on real food samples, this method may be a good alternative to the official AOAC 997.08 method, especially
in laboratories which do not have HPAEC-PAD chromatographic technology at their disposal.
Pro stanovení fruktanů byla implementována a interně validována metoda HPLC s refraktometrickou detekcí a NH2 kolonou. Stejně jako
ostatní metody je založena na bilanci glukosy a fruktosy před a po hydrolýze fruktanů inulinasou. V prvé fázi testování byly
za optimalizovaných chromatografických podmínek prokázány velmi dobré separační vlastnosti použité NH2 kolony pro směs glukosy,
fruktosy, sacharosy, 1-ketosy, nystosy a 1-F-fruktofuranosylnystosy. Při interní validaci byly pro stanovení fruktanů ve standardním
materiálu určeny směrodatná odchylka sr = 0,2; rozšířená nejistota stanovení U = ±0,4 % a průměrná výtěžnost 97,9 %. Směrodatné
odchylky stanovení fruktanů v 5% roztocích komerčních materiálů Orafti P95, Orafti GR a Actilight 950P byly velmi nízké,
a to 0,04; 0,05 resp. 0,04, což odpovídá rozšířené nejistoty stanovení
U = ±0,1 %. Průměrná výtěžnost stanovení přítomných fruktanů,
orientačně posouzená srovnáním s obsahem fruktanů deklarovaných výrobcem, se pohybovala v rozmezí 96,9–99,3 %. Touto metodou lze
dobře separovat a identifikovat i jednotlivé oligomery fruktanů s DP 2–6, a to jak typ GFn, tak Fn, což lze využít pro rozlišení
jednotlivých druhů fruktanů. Závěrem lze konstatovat, že navrhovaná metoda dává dobré předpoklady pro stanovení fruktanů a po
ověření na vzorcích reálných potravin může být vhodnou alternativou
k oficiální metodě AOAC 997.08 v těch laboratořích, které
nedisponují chromatografickou technikou HPAEC-PAD.
Klíčová slova: stanovení fruktanů, metoda HPLC-RI, NH2 kolona, interní validace.